化妝品皮膚光毒性試驗完整流程：從樣品制備到結(jié)果判定

109次 2025.10.20

　　在化妝品安全性評估體系中，皮膚光毒性試驗是排查“光敏風(fēng)險”的核心環(huán)節(jié)。無論是美白、防曬類產(chǎn)品，還是含植物提取物的護膚品，都需通過規(guī)范的試驗流程驗證安全性——從前期樣品的精準(zhǔn)制備，到試驗過程的嚴(yán)格操作，再到最終科學(xué)的結(jié)果判定，每一步都直接影響檢測結(jié)論的準(zhǔn)確性。


化妝品皮膚光毒性試驗


　　化妝品皮膚光毒性試驗完整流程


　　1.樣品制備：


　　化妝品形態(tài)多樣，需通過標(biāo)準(zhǔn)化方法將其轉(zhuǎn)化為可用于試驗的“均一體系”，避免因樣品不均導(dǎo)致結(jié)果偏差。具體流程如下：


　　固體/半固體樣品（膏霜、面膜）：取10-20g樣品，加入適量生理鹽水或無血清培養(yǎng)基，在37℃恒溫水浴中攪拌至完全溶解，通過0.22μm無菌濾膜過濾，制備成5個梯度濃度的樣品溶液。


　　液體樣品（精華、爽膚水）：直接用無血清培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度，若含酒精、香精等揮發(fā)性成分，需先在4℃低溫環(huán)境下平衡2小時，避免稀釋過程中成分揮發(fā)影響濃度準(zhǔn)確性。


　　特殊劑型（噴霧、粉餅）：噴霧樣品需收集霧化后的液體，粉餅樣品則研磨成細(xì)粉后，按固體樣品制備方法溶解稀釋。


　　關(guān)鍵要求：樣品制備全程需在無菌超凈工作臺操作，每個濃度設(shè)置3個平行樣，同時制備“空白對照液”和“陽性對照液”。


　　2.體外試驗：


　　3T3中性紅攝取光毒性試驗方法通過觀察細(xì)胞在“樣品+紫外線”作用下的存活率，判斷光毒性，全程約5-7天，具體流程分為“細(xì)胞處理-紫外線照射-毒性檢測”三階段：


　　階段1：細(xì)胞染毒與分組培養(yǎng)（第1-2天）


　　分組設(shè)置：將96孔板分為4組，每組3個平行孔，確保變量唯一：


　　①加藥照射組：加入不同濃度樣品溶液+后續(xù)紫外線照射；


　　②加藥避光組：加入不同濃度樣品溶液+全程避光培養(yǎng)；


　　③空白照射組：僅加無血清培養(yǎng)基+后續(xù)紫外線照射；


　　④空白避光組：僅加無血清培養(yǎng)基+全程避光培養(yǎng)。


　　染毒培養(yǎng)：將4組培養(yǎng)板放入37℃CO?培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時（讓細(xì)胞充分接觸樣品成分，模擬皮膚接觸化妝品后的吸收過程）。


　　階段2：紫外線照射與后續(xù)培養(yǎng)（第3天）


　　照射前準(zhǔn)備：取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔沖洗2次（去除未被細(xì)胞吸收的樣品殘留，避免干擾照射效果），再加入新鮮無血清培養(yǎng)基。


　　紫外線照射：僅對“加藥照射組”和“空白照射組”進(jìn)行紫外線照射，照射過程中培養(yǎng)板需置于冰浴托盤（維持25±2℃，避免照射產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞），照射時間根據(jù)校準(zhǔn)后的劑量計算（通常為20-30分鐘）；“加藥避光組”和“空白避光組”則用鋁箔紙包裹培養(yǎng)板，置于同一培養(yǎng)箱中避光處理。


　　后續(xù)培養(yǎng)：照射完成后，所有組均放回37℃CO?培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24小時（觀察細(xì)胞在照射后的損傷反應(yīng)）。


　　階段3：中性紅染色與細(xì)胞存活率檢測（第4天）


　　染色操作：吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入50μL中性紅染液（濃度0.05%，提前用PBS配制并過濾），37℃孵育3小時（中性紅可被活細(xì)胞吞噬進(jìn)入溶酶體，死細(xì)胞無此能力）。


　　脫色與檢測：用PBS沖洗3次去除多余染液，每孔加入100μL脫色液（乙酸：乙醇：水=1:50:49），室溫振蕩30分鐘至細(xì)胞內(nèi)染料完全釋放，隨后用酶標(biāo)儀在540nm波長下檢測每孔吸光度（OD值）。


　　3.結(jié)果判定：


　　試驗數(shù)據(jù)需通過標(biāo)準(zhǔn)化計算，結(jié)合法規(guī)閾值判定樣品是否具有光毒性，體外試驗（3T3NRUPT）結(jié)果判定如下：


　　通過計算“細(xì)胞存活率”和“光毒性指數(shù)（PI）”評估風(fēng)險，具體公式如下：


　　細(xì)胞存活率（%）：


　　加藥組存活率=（加藥組平均OD值/空白對照組平均OD值）×100%


　　（注：加藥照射組對應(yīng)空白照射組，加藥避光組對應(yīng)空白避光組）


　　光毒性指數(shù)（PI）：


　　PI=加藥避光組50%細(xì)胞毒性濃度（IC50）/加藥照射組50%細(xì)胞毒性濃度（IC50）


　　（IC50指使細(xì)胞存活率降至50%的樣品濃度，通過不同濃度存活率擬合曲線計算得出）


　　判定標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)OECD指南432）：


　　若PI≥5，且加藥照射組細(xì)胞存活率隨濃度升高顯著下降（呈現(xiàn)劑量依賴性），判定為“具有光毒性”；


　　若PI<3，且無劑量依賴性，判定為“無明顯光毒性”；


　　若3≤PI<5，需增加1個更高濃度樣品重復(fù)試驗，或結(jié)合“人角質(zhì)形成細(xì)胞光毒性試驗”進(jìn)一步驗證。


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