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石蠟包埋（石蠟切片免疫組化）
組織的采集、固定和保存：
采取組織后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小時（根據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時間）或過夜
方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 過夜（成年 tesis）
PBS緩沖液洗三次，每次5min，4°C保存于70%乙醇中。
組織的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的樣品經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，52-54°C石蠟包埋，常規(guī)切片，切片厚4 -10mm，貼于處理過的干凈載玻片上，37°C烤片過夜，之后收集于載片盒中，RT密封保存。
石蠟包埋：
保存于4°C 70%乙醇中的組織樣品
ˉ
80%乙醇 15 min
ˉ
95%乙醇 15 min
ˉ
100%乙醇 15min ′ 2
ˉ
1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
ˉ
二甲苯透明 5-10 min
ˉ
1/2二甲苯1/2石蠟 30 min
ˉ
石蠟（1） 5hr
ˉ
石蠟（2） 5-5hr
ˉ
石蠟（3） 包埋
ˉ
RT保存
石蠟組織切片的免疫組化方法：
密封保存于RT的組織切片
ˉ
二甲苯(1) 20 min
ˉ
二甲苯(2) 20 min
ˉ
100%乙醇 20min
ˉ
95%乙醇 10 min
ˉ
80%乙醇 10 min
ˉ
通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織周圍畫圈
ˉ
切片在PBS中浸泡 5 min*2
ˉ
0.4%Tritonx RT 10 min
ˉ
切片在PBS中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
傾去blocking buffer，勿洗
一抗4°C overnight in blocking buffer
取出切片復(fù)溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB顯色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
如果是增強(qiáng)型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS終止顯色，HE襯染1s，
玻片架放入泡沫盒，流水沖洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若顏色太深，可用0.1-0.5%鹽酸乙醇分色1～2秒鐘（或更久）
脫水85%乙醇 5 min
ˉ
95%乙醇 5 min
ˉ
無水乙醇 5 min
ˉ
無水乙醇 5min
ˉ
二甲苯(1) 10min
ˉ
二甲苯(2) 10min
ˉ
中性樹膠封片，室溫干燥保存
石蠟組織切片的免疫熒光方法：
密封保存于RT的組織切片
ˉ
二甲苯(1) 20 min
ˉ
二甲苯(2) 20 min
ˉ
100%乙醇 20min
ˉ
95%乙醇 10 min
ˉ
80%乙醇 10 min
ˉ
通風(fēng)櫥晾干，阻水筆在組織周圍畫圈
ˉ
切片在PBS中浸泡 5 min*2
ˉ
0.4%Tritonx RT 10 min
ˉ
切片在PBS中浸泡 5 min*3
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
傾去blocking buffer，勿洗
一抗4°C overnight in blocking buffer
取出切片復(fù)溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
熒光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h
DAPI（1：1000請根據(jù)二抗說明稀釋二抗）
切片在PBS中浸泡 5 min*3
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