一.導(dǎo)言

生物學(xué)特性

霍亂弧菌為革蘭氏陰性細菌，呈弧形或逗號狀，無芽孢和菌毛。有些菌株有莢膜，一端有又粗又長的鞭毛，而且很活躍。以霍亂病人的大米泔水樣糞便為活菌懸液滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈梭形或流星狀運動。顯微鏡下，液體培養(yǎng)液滴染色，可見“魚群”狀排列的弧菌。人工培養(yǎng)后容易失去弧形，變成桿狀。

對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，在pH 8-2范圍內(nèi)均可生長，耐堿，在pH 8-0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因為其他細菌在這個pH值下不易生長，所以堿性蛋白胨水可以作為霍亂弧菌選擇性增殖的培養(yǎng)基。

堿性平板上菌落直徑2mm，圓形，光滑透明?；魜y弧菌對熱、干燥、陽光、化學(xué)消毒劑和酸非常敏感，能耐受低溫:濕熱55℃15分鐘，100℃1-2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘即可殺滅；0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒的目的；在正常胃酸中僅存活4分鐘?；魜y弧菌是一種需氧或兼性厭氧菌，可在16-44℃生長，最適生長溫度為37℃。

流行病學(xué)特征

霍亂弧菌是霍亂的病原，是一種急性、烈性腸道傳染病，以嚴重嘔吐、腹瀉、失水為特征，起病急，傳染性強，死亡率高，屬于國際檢疫傳染病。有139個血清群，其中O1和O139可引起霍亂?；魜y弧菌O1和O139是霍亂(一種嚴重的腸道傳染病)的病原體。在自然情況下，人類容易感染霍亂弧菌。人們通過攝入被霍亂弧菌污染的食物或水引發(fā)霍亂。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛穿過腸粘膜表面的粘液層，接近腸粘膜上皮細胞，被普通菌毛定殖。腸道環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產(chǎn)生霍亂腸毒素，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

霍亂弧菌的主要致病因子是霍亂毒素(CT)。CT是目前已知最強的腹瀉毒素，可引起大量腸液分泌，導(dǎo)致嚴重的嘔吐和腹瀉，體內(nèi)大量水分和電介質(zhì)流失，產(chǎn)生嚴重的水樣腹瀉綜合征?；魜y弧菌引起的主要病變是嚴重脫水，臨床上表現(xiàn)為指紋干癟，皮下組織和肌肉干癟。心、肝、脾等器官全部被縮小。內(nèi)臟漿膜暗淡。腸腔高度擴張，腸內(nèi)充滿泔水樣液體，腸黏膜松弛，但黏膜上皮完整，無潰瘍。膽囊充滿了粘稠的膽汁。以及腎小球間質(zhì)毛細血管擴張、腎小管腫脹、變性和壞死。其他器官也有出血、變性等變化。

二、檢查流程

參考標準為SN/T 1022—2010《進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》。本標準規(guī)定了進出口食品中霍亂弧菌的檢驗方法，適用于食品中霍亂弧菌的檢驗。動物飼料等食品生產(chǎn)加工領(lǐng)域環(huán)境樣品中霍亂弧菌的檢驗可借鑒。

霍亂弧菌檢驗程序如圖1所示:

圖1

媒介識別和結(jié)果判斷

①TCBS培養(yǎng)基

原理:蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉能刺激弧菌的生長；蔗糖是一種可發(fā)酵的糖；膽酸鈉、牛膽汁粉、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉和較高的pH值能抑制革蘭氏陽性菌和大腸桿菌。硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵反應(yīng)作為檢測硫化氫產(chǎn)生的指示劑；溴百里酚藍和百里酚藍是pH指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

用法:稱取本品89克，煮沸后溶于1000毫升蒸餾水中。冷卻至45-50℃時，倒入無菌盤中備用。注意:不需要高壓滅菌。

結(jié)果:TCBS上的霍亂弧菌呈圓形、光滑、黃色，直徑2mm～3mm。具體測試結(jié)果如圖2所示:

圖2霍亂弧菌在非01 TCBS培養(yǎng)基中的生長結(jié)果

②慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基

原理:蛋白胨、牛肉粉可以提供氮源、維生素、礦物質(zhì)、生長因子；提供蔗糖作為碳源；即利用氯化鈉滿足霍亂弧菌嗜鹽生長的要求，同時形成不利于其他細菌生長的高滲透壓。亞硫酸鈉能刺激弧菌生長；慶大霉素、亞碲酸鉀和較高的pH值能抑制革蘭氏陽性菌和一些革蘭氏陰性菌的生長。檸檬酸鈉可以保護霍亂弧菌免受其他抗菌物質(zhì)的侵害?；魜y弧菌對酸性環(huán)境敏感，所以這個pH值可以促進其生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

用法:稱取本品50克，加熱攪拌溶解于1000毫升蒸餾水中，待冷卻至50℃左右，加入0.5毫升無菌1%亞碲酸鉀溶液，混勻，倒入無菌盤中備用。不需要高壓滅菌。

結(jié)果:霍亂弧菌在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上呈微藍灰色、半透明、扁平、微凸起。如果長時間培養(yǎng)或室溫放置，黑色金屬碲會沉淀在菌落中心。具體測試結(jié)果如圖3所示:

菌落略呈藍灰色，半透明，扁平，略凸起。

延長培養(yǎng)時間后，菌落中心形成黑色金屬碲沉淀。

③氯化鈉三糖鐵瓊脂

原理:蛋白胨、牛肉粉、酵母粉提供碳氮源、維生素和礦物質(zhì)；乳糖、葡萄糖和蔗糖是可發(fā)酵的糖。當它們分解產(chǎn)生酸時，用酚紅酸堿指示劑測定。酸性是黃色，堿性是紅色。有些細菌能分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀。較高含量的氯化鈉會促進弧菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

用法:稱取本品65克，加入1000毫升蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝于試管中，121℃高壓滅菌15分鐘備用。

結(jié)果:霍亂弧菌在氯化鈉三糖鐵斜面上反應(yīng)，底部為黃色，斜面為黃色，不產(chǎn)生硫化氫和氣體。具體測試結(jié)果如圖4所示:

④氯化鈉營養(yǎng)瓊脂

原理:蛋白胨和牛肉粉能為微生物生長提供碳氮源、維生素和生長因子；高含量的氯化鈉可促進霍亂弧菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

用法:稱取本品30克，加熱溶解于1000毫升蒸餾水中，分裝于三角瓶中或試管中，121℃滅菌15分鐘。

結(jié)果:霍亂弧菌在氯化鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后的菌落呈圓形，邊緣半透明，中心不透明，直徑約3mm。具體測試結(jié)果如圖5所示:

生化鑒定和結(jié)果判斷

①革蘭氏染色

所用試劑:革蘭氏染色試劑盒。

原理:結(jié)晶紫初染和碘溶液媒染后，細胞壁內(nèi)形成不溶于水的結(jié)晶紫與碘的絡(luò)合物。革蘭氏陽性菌，由于細胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)絡(luò)多層，交聯(lián)密集，用乙醇或丙酮脫色時，會因失水而使網(wǎng)眼縮小。此外，它不含脂類，因此結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物可以牢固地留在壁中并保持紫色。但由于細胞壁薄，外膜脂質(zhì)含量高，肽聚糖層薄，交聯(lián)度差，以脂質(zhì)為主的革蘭氏陰性菌外膜在接觸脫色劑時迅速溶解，薄而疏松的肽聚糖網(wǎng)絡(luò)不能阻止結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物的溶解，所以用乙醇脫色后仍無色，再用沙黃等紅色染料染紅，使革蘭氏陰性菌呈紅色。

結(jié)果:霍亂弧菌為革蘭氏陰性細菌，呈弧形或彎曲狀。染色結(jié)果如圖6所示:

②氧化酶試驗

所用試劑:氧化酶試紙。

原理:氧化酶，即細胞色素氧化酶，是細胞色素呼吸酶系的末端呼吸酶。氧化酶先氧化細胞色素C，然后這個氧化的細胞色素C氧化對苯二胺產(chǎn)生顯色反應(yīng)。用細玻璃棒或一次性接種針挑取單菌落，涂于試紙上。30s內(nèi)變成藍色或藍紫色為陽性，不變色為陰性。

結(jié)果:選擇營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)的單菌落進行氧化酶試驗，霍亂弧菌氧化酶陽性。測試結(jié)果如圖7所示:

③生化識別試紙條試驗

所用試劑:青島海博HBI霍亂弧菌生化鑒定試紙(SN)。

試劑介紹:用于霍亂弧菌的生化鑒定。成分:ONPG、脲酶、明膠、精氨酸雙酶肉湯、鳥氨酸脫羧酶肉湯、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、無鹽胰蛋白胨水、2%氯化鈉胰蛋白胨水、6%氯化鈉胰蛋白胨水、8%氯化鈉胰蛋白胨水、10%氯化鈉胰蛋白胨水、靛藍基質(zhì)、1%氯化鈉乳糖、1%氯化鈉纖維二糖、1 (SN標準)。

操作:取裝有2ml無菌生理鹽水的試管，用接種針從氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板上挑取部分菌落，放入無菌生理鹽水中，仔細研磨，制成0.5麥克米倫濁度的均勻菌懸液，取無污染生化鑒定條，每孔加入100ul菌懸液，其中固體和半固體生化管穿刺接種，鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸對照需用無菌石蠟覆蓋。接種后做好標記，蓋好蓋子，放入底座中，置于36℃±1℃培養(yǎng)(42℃生長，42℃培養(yǎng))。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄測試結(jié)果。具體測試結(jié)果如圖8所示:

非01型霍亂弧菌生化鑒定結(jié)果

生化項目

結(jié)果判斷

生化形狀

生化項目

結(jié)果判斷

生化形狀

鄰-硝基苯-β-d-半乳糖苷

+

黃色

8%氯化鈉蛋白胨水

﹣

沒有增長

脲酶

﹣

黃色

10%氯化鈉蛋白胨水

﹣

沒有增長

凝膠

+

液態(tài)

1%氯化鈉甘露醇

+

紅色

鳥氨酸

+

紫色

1%氯化鈉乳糖

﹣

不變顏色

賴氨酸

+

紫色

1%氯化鈉纖維二糖

﹣

不變顏色

氨基酸控制

﹣

黃色

1%氯化鈉阿拉伯糖

﹣

不變顏色

精氨酸

﹣

黃色

1%氯化鈉蔗糖

+

紅色

無鹽蛋白胨水

+

變得渾濁

靛藍矩陣

+

紅色戒指

2%氯化鈉蛋白胨水

+

變得渾濁

40℃下的生長試驗

+

變得渾濁

6%氯化鈉蛋白胨水

﹣

沒有增長

氧化酶

+

紫色

注:+表示陽性；-沒有。

注意事項:1。靛藍基質(zhì)試驗過程中，應(yīng)在培養(yǎng)結(jié)束后加入2-4滴Kovacs靛藍基質(zhì)試劑，混勻后4小時內(nèi)觀察結(jié)果；鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸質(zhì)控品應(yīng)覆蓋無菌液體石蠟。

三。結(jié)果摘要

TCBS上的霍亂弧菌呈圓形、光滑、黃色，直徑2mm ~ 3mm在慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基上，略呈青灰色，半透明，扁平，略凸起，如延長培養(yǎng)或室溫，菌落中央有黑色金屬碲沉淀；氯化鈉三糖鐵斜面上反應(yīng)，底部黃色，斜面黃色，不產(chǎn)生硫化氫或氣體。純化后在氯化鈉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，邊緣半透明，中心不透明，直徑約3mm；革蘭氏染色試驗鑒定為革蘭氏陰性，呈弧形或弧形；在氧化酶試紙上呈紫色，為陽性實驗結(jié)果；在無鹽蛋白胨水和2%氯化鈉蛋白胨水中生長；6%氯化鈉蛋白胨水、8%氯化鈉蛋白胨水和10%氯化鈉蛋白胨水生長不旺盛。ONPG是積極的；脲酶陰性；明膠呈陽性；鳥氨酸和賴氨酸脫羧酶陽性；氨基酸對照和精氨酸為陰性；蔗糖和甘露醇呈陽性；乳糖、纖維二糖和阿拉伯糖為陰性；靛藍基質(zhì)試驗呈陽性；在42℃的恒溫培養(yǎng)箱中生長。除上述試驗外，霍亂弧菌的檢測還可作為血清學(xué)分型及其他相關(guān)試驗。

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