標(biāo)記基因(標(biāo)記基因篩選原理)

騎士&楊-。(2021).宏基因組分析器基準(zhǔn)測試的挑戰(zhàn)。自然方法，土井:https://doi.org/1038/s41592-021-01141-3

隨著越來越多的研究揭示微生物組與人類健康的密切關(guān)系，宏基因組測序，尤其是全基因組鳥槍法測序(WMS)，作為微生物組最重要的研究方法之一，在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界得到了廣泛的應(yīng)用。為了解釋高通量WMS數(shù)據(jù)，許多用于物種分類的生物信息學(xué)工具被開發(fā)出來，其中包括MetaPhlAn、北海巨妖、PathSeq等。，可以避免繁重的計(jì)算任務(wù)，如拼接，已被應(yīng)用于大量的宏基因組研究物種。然而，目前對這些工具的正確評價(jià)和使用以及相應(yīng)輸出結(jié)果的解釋還沒有引起足夠的重視。例如，不同工具的輸出結(jié)果差異很大，研究者往往將其歸因于不同工具使用的數(shù)據(jù)庫的差異。然而，我們發(fā)現(xiàn)不同信息生成工具輸出的“豐度類型”存在根本差異，這是信息生成工具之間分析結(jié)果差異的本質(zhì)原因之一。忽略這種豐度類型的差異將改變信息生成工具的性能評估結(jié)果，并深刻影響宏基因組測序數(shù)據(jù)的解釋。此外，這個問題還會嚴(yán)重阻礙元研究，影響交叉研究之間結(jié)果的可比性，導(dǎo)致微生物組研究的臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化困難。

2021年5月13日，哈佛醫(yī)學(xué)院的劉陽宇和加州大學(xué)圣地亞哥分校的Rob Knight發(fā)表了一篇題為《在Nature Methods上對宏基因組譜儀進(jìn)行基準(zhǔn)測試的挑戰(zhàn)》的論文。通過數(shù)據(jù)模擬，本研究對宏基因組物種分類工具的輸出結(jié)果進(jìn)行了深度解讀，創(chuàng)造性地提出了基于不同豐度類型(基于物種分類的序列或相對豐度)的雙重評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，為解決微生物組研究中如何選擇宏基因組物種分類工具的問題提供了重要依據(jù)，也為微生物組標(biāo)準(zhǔn)化研究提出了一系列建設(shè)性建議。

圖:物種分類(標(biāo)記基因，如MetaPhlAn2)和基于序列的方法(如Kraken2)存在巨大差異，主要受微生物基因組大小的影響。

在宏基因組測序分析中，序列豐度和分類豐度是兩種不同類型的相對豐度。前者的序列豐度是計(jì)算屬于某一物種的測序DNA在整個植物區(qū)系DNA中所占的百分比，后者的分類豐度則代表某一物種的個體在整個植物區(qū)系中所占的百分比。基因組學(xué)的物種分類工具根據(jù)其使用的數(shù)據(jù)庫類型可以分為三類:DNA-to-DNA、DNA-to-Protein和DNA-to-Marker。通過設(shè)計(jì)一個簡單的模擬菌群，我們發(fā)現(xiàn)不同工具的相對豐度類型并不一致。例如，DNA-to-DNA方法(代表軟件北海巨妖和Bracken)的輸出豐度類型是序列豐度，而DNA-to-Marker方法(代表軟件MetaPhlAn和mOTUs)的輸出豐度類型是物種豐度(如下圖1所示)。

圖一。三種物種定量方法的比較。a .模式圖；b .兩個基因組的模擬群落；c .不同軟件的定量結(jié)果。

通過模擬數(shù)據(jù)，研究人員使用序列豐度和物種豐度作為金標(biāo)準(zhǔn)來評估宏基因組學(xué)中不同的物種分類工具。結(jié)果表明，當(dāng)以序列豐度為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，DNA-to-DNA法的結(jié)果優(yōu)于DNA-to-Marker法，而以物種豐度為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，結(jié)果則相反。因此，物種分類軟件的性能與作為評價(jià)金標(biāo)準(zhǔn)的相對多度類型密切相關(guān)。

混淆序列豐度和物種豐度將對宏基因組數(shù)據(jù)的解釋產(chǎn)生四個重要影響:

在物種組成分析方面:如果以序列豐度作為解釋標(biāo)準(zhǔn)，就會高估大基因組物種，低估小基因組物種在植物區(qū)系中的真實(shí)數(shù)量。在復(fù)雜的菌群中，微生物基因組的大小變化很大。僅在細(xì)菌內(nèi)部，基因組的差異理論上可以達(dá)到100倍，而微生物跨物種(如病毒和真菌)的基因組差異是不可估量的。了解序列豐度和物種豐度對于設(shè)定病原菌臨床診斷的閾值是非常重要的。

在α多樣性方面:與使用物種多度相比，如果以序列多度作為解釋標(biāo)準(zhǔn)，樣本的α多樣性(Shannon、Simpson和Pielou的均勻度指數(shù))會整體降低，但這種變化并不是嚴(yán)格一致的，部分樣本的α多樣性反而會增加。目前，宏基因組研究受到樣本量的限制，會導(dǎo)致微生物樣本α多樣性排序的混亂，進(jìn)而影響個體和群體間α多樣性的一致性和可重復(fù)性。

在β多樣性方面:通過設(shè)計(jì)模擬菌群，我們比較了基于不同β多樣性分析方法(BC、rJSD、LLrAD)的兩種不同相對豐度的樣本之間的關(guān)系。通過檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)用序列多度描述的樣品之間的關(guān)系與用物種多度描述的樣品之間的關(guān)系不同，相關(guān)性為0.51-0.94。因此，通過將不同信息生成工具的輸出結(jié)果作為下游分析的起點(diǎn)，可以獲得不同的樣本間或組間關(guān)系。

排序分析:排序分析是一種常用的宏基因組分析方法，通過將N維物種組成數(shù)據(jù)降維到二維或三維來比較和顯示個體或群體之間的差異。對于同一批樣品，基于序列多度和物種多度的排列分析結(jié)果差異較大。無論是NDMS方法、PCoA方法、t-SNE方法還是UMAP方法生成的二維散點(diǎn)圖，其一致性分析都顯示出很大的差異。也就是說，在基于不同信息生成工具的下游分析中，有可能組與組之間的差異是不可重復(fù)的。

通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼撟C和分析，量化了宏基因組學(xué)物種分類工具產(chǎn)生的兩種相對多度類型的差異，對混淆兩種多度類型的影響進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究。由于大量未知微生物基因組和多倍體信息缺失，物種多度向序列多度的轉(zhuǎn)換比較困難，往往達(dá)不到預(yù)期目標(biāo)。因此，選擇合適的宏基因組物種分類工具非常重要。目前，DNA-to-DNA方法(以北海巨妖為代表，產(chǎn)生序列豐度)和DNA-Marker方法(以MetaPhlAn為代表，產(chǎn)生物種豐度)都是宏基因組研究中的重要工具，并被應(yīng)用于大量研究。雖然在方法一致的前提下，豐度的差異不會影響同一實(shí)驗(yàn)的組間比較，但必然會影響許多已發(fā)表的微生物組相關(guān)研究結(jié)論的可解釋性，也會給回顧性薈萃分析帶來巨大挑戰(zhàn)。因此，我們呼吁微生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員認(rèn)真解讀宏基因組測序的結(jié)果，嚴(yán)格區(qū)分相對豐度的類型，重新審視以往基于序列豐度的研究結(jié)論。鑒于物種多度的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義，我們還建議您開發(fā)更多基于DNA-to-Marker方法的宏基因組學(xué)物種分類工具。

這篇論文的第一作者是哈佛醫(yī)學(xué)院的孫正博士和加州大學(xué)圣地亞哥分校的黃石博士。羅布·奈特教授和劉陽宇教授是本文的通訊作者。

不同領(lǐng)域物種的序列和分類兩個定量結(jié)果的相關(guān)分析。

圖3。利用Bracken、KrakenmOTUs2和MetaPhlAn2軟件對模擬群落不同估算方法的定量結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。

圖4?；谛蛄泻臀锓N豐度計(jì)算α多樣性

圖5。兩種定量方法對不同樣本類型結(jié)果的排序分析。

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